农药残留的酶活性抑制与免疫分析技术的免疫分析法(十)

时间:2019-03-02 18:56:55 来源:诺亚彩票 作者:匿名


(5)杂交瘤细胞培养和抗体分离将选择的阳性杂交瘤细胞在CO 2培养箱中体外培养,从培养液中分离单克隆抗体。或者,将BALB/c小鼠或其亲本小鼠腹膜内注射4-甲基十五烷或液体石蜡,并在1周后将杂交瘤细胞接种到小鼠的腹膜腔中。在接种后1周收集小鼠的腹水,分离腹水中的单克隆抗体。

3.抗体纯化的纯化方法单克隆抗体与多克隆抗体的纯化方法相似。纯化单克隆抗体的最有效方法是免疫亲和层析,其将葡萄球菌蛋白A或抗小鼠免疫球蛋白与合适的载体(最常见的是Sepharose)交联以制备免疫亲和柱。结合并洗脱抗体,回收率可达90%以上。

(IV)标记物的制备和纯化

根据所选择的免疫测定方法,半抗原,抗原和抗体被不同地标记。常用的标记物如酶联免疫吸附测定(ELISA)是辣根过氧化物酶(HRP),碱性磷酸酶(AP)等,通常用于流动注射免疫测定(FIIA)。用鲁米诺等标记,(ABS)系统中使用的标记物是生物素,并且用于金标记免疫测定的标记物是纳米金标记物。

1.半抗原的标记和纯化

根据标记的类型和半抗原的反应基团,通过不同的标记方法确定半抗原的标记。例如,含有游离羧基的半抗原用辣根过氧化物酶标记,通常用碳二亚胺法,活性酯法或混合酸酐法。通过辣根过氧化物酶含有游离氨基的半抗原可以是戊二醛法,二异硫氰酸酯法等。应该注意的是,辣根过氧化物酶催化活性氧物质从过氧化物中释放,并且一些化学稳定且不易氧化的半抗原(例如酚类化合物)与辣根过氧化物酶共价偶联。在此过程中,应注意避免氧气并防止半抗原被氧化,导致无法识别的抗体。

酶标记的半抗原的纯化可以通过透析或超滤离心进行。用小分子标记物标记的半抗原可以通过薄层色谱和柱色谱分离和纯化。2.抗原的标记和纯化

抗原的标记取决于抗原的类型和特征。在农药免疫测定中,使用的抗原是合成的(半抗原和载体蛋白的偶联),因此标记可以在人工抗原的载体蛋白上标记。蛋白质抗原的标记和纯化类似于抗体的标记和纯化方法。

3.抗体的标记和纯化

抗体的标记根据标记使用不同的标记方法。辣根过氧化物酶标记的抗体通常采用改进的高碘酸盐方法,其中辣根过氧化物酶分子中糖的醇羟基被氧化成醛基并与抗体的游离氨基共价偶联。含有游离羧基(如生物素等)和游离氨基(如辣根过氧化物酶)的标记与抗体的偶联类似于含有游离羧基和氨基的半抗原的共价偶联。载体蛋白。 。将含芳香族伯胺的标记物重氮化以在抗体分子中的酪氨酸残基的酚羟基邻位形成偶氮键。含异氰酸酯的标记可以直接与抗体的游离氨基偶联。为了防止标记抗体与抗体的抗原结合位点偶联,抗体的免疫活性降低,并且标记可以通过以下方式与单链抗体的巯基共价连接。马来酰亚胺活性酯等方法,因为抗体的抗原结合位点不含硫醇基。纳米金标记的抗体被物理吸附。

标记抗体的纯化方法根据标记的分子大小而不同。如果标记是小分子化合物,则标记抗体的纯化可以通过透析或离心超滤进行。如果标记是大分子(例如辣根过氧化物酶),则标记抗体的纯化通常通过Sephadex凝胶柱层析进行。如果半抗原用小分子标记物标记,可以通过薄层色谱或硅胶柱色谱法分离和纯化。

(五)建立免疫分析技术和优化条件

1,抗原和抗体浓度的选择

在抗原 - 抗体反应中,抗体的浓度需要与抗原浓度相容,并且通常通过方阵法筛选抗原 - 抗体的最佳浓度组合。

(1)在间接竞争性酶联免疫吸附测定中选择涂层和抗体的浓度,以及用于激发酶联免疫吸附测定的涂层和抗体的浓度的选择程序如下。1包装:将包装用标准pH 9.6碳酸盐缓冲液稀释至一定浓度系列,100μL/孔,涂布不同行的酶板,空白对照孔加等体积缓冲液,4℃吸附过夜。

2封闭:第二天滗析涂层溶液,洗涤并洗涤游离物质,加入150μL/孔的封闭溶液,并将混合物在37℃下封闭1.5小时。洗净去除释放。

3反应:将抗体用适当pH的磷酸盐缓冲液(PB)稀释至一定浓度系列,加入酶板的不同柱,100μL/孔,37℃反应1~1.5h。洗净去除释放。

4加酶标准二抗:将酶标准二抗稀释至工作浓度,加入酶板,100μL/TL,37°C反应1~1.5 h。洗净去除释放。

5颜色测量:加入100μL/孔的底物和显色剂混合物,避免在37°C下与光反应15分钟。通过加入50μL/孔终止剂终止反应,并在酶标仪上测量每个孔的吸光度。

将原始浓度和抗体浓度绘制在横坐标上,并将吸光度绘制在纵坐标上。选择吸光度曲线的拐点处的抗原和抗体浓度为具有约1.0的吸光度值,较低的涂布机和抗体浓度的最佳浓度组合。

(2)涂层抗原的选择和直接酶联免疫吸附试验测定涂层中的涂层浓度和酶标抗体直接竞争酶联免疫吸附试验,选择涂层原始酶和酶标抗体浓度为如下。

1包装:将包装用9.6的pH缓冲液稀释至一定浓度系列,涂上不同行的酶板,100μL/TL,空白对照孔加等体积缓冲液,4°C吸附过夜。

7封闭:第二天滗析涂层溶液,洗涤并洗涤游离物质,向其中加入150μL/TL的封闭溶液,并将混合物在37℃下封闭1.5小时。洗净去除释放。

3反应:将酶标抗体稀释至工作浓度系列,加入酶板的不同柱,100μL/孔,并在37℃反应1至1.5小时。洗净去除释放。

4颜色测量:加入100μL/孔的底物和显色剂混合物,避免在37°C下与光反应15分钟,用50μL/孔的终止剂停止反应,并在酶标仪上测量每个孔的吸光度。在横坐标上绘制涂层的初始浓度和酶标记的抗体的浓度,并在纵坐标上绘制吸光度。选择在约1.0的吸光度曲线的拐点处的原始和酶标记的抗体浓度的组合作为最佳浓度。

(3)包被抗体的选择抗体和酶标记半抗原浓度的直接竞争酶联免疫吸附试验在包被抗体直接竞争酶联免疫吸附试验中,选择抗体和酶标记半抗原浓度的步骤如下。

1涂层:将抗体用合适的pH磷酸盐缓冲液稀释至一定浓度系列,并涂上不同行的酶板,100μL/TL,空白对照孔加等体积的磷酸盐缓冲液,在40℃下吸附过夜。

2闭合:第二天滗析包衣溶液,洗涤并洗涤游离物质,加入150μL/TL的封闭溶液,并将混合物在37℃下封闭1.5小时。洗净去除释放。

3反应:将酶标记的半抗原用磷酸盐缓冲液稀释成一定浓度系列,并加入到酶板的不同柱中,100μL/TL,并在37℃反应1至1.5小时。洗净去除释放。

参考:农药残留分析

相关链接:

农药残留酶活性的抑制及免疫分析技术的免疫分析(I)

农药残留酶活性的抑制及免疫分析技术的免疫分析(II)

农药残留酶活性的抑制及免疫分析技术的免疫分析(III)

抑制农药残留酶活性及免疫分析技术免疫分析(4)

抑制农药残留酶活性及免疫分析技术免疫分析(5)

抑制农药残留酶活性及免疫分析技术免疫分析(6)

抑制农药残留酶活性和免疫分析技术免疫分析(七)

抑制农药残留酶活性及免疫分析技术免疫分析(8)

抑制农药残留酶活性及免疫分析技术免疫分析(9)

[关键词]农药残留,酶活性抑制,免疫分析,国家标准物质网络

>

下一页:漂白剂的测定(1)